最新研究成果 RDS，可体外抑制新冠、非典及甲型流感病毒感染者

A traditional medicine, respiratory detox shot (RDS), inhibits the infection of SARS-CoV, SARS-CoV-2, and the influenza A virus in vitro

Brian Hetrick1, Dongyang Yu2, Adeyemi A. Olanrewaju1, Linda D. Chilin1, Sijia He1, Deemah Dabbagh1,Ghaliah Alluhaibi1, Yuan - Chun Ma3, Lewis A. Hofmann4, Ramin M. Hakami1 and Yuntao Wu1*

▋简要

文化背景：目前于是以蔓延当今世界的新型传染伤寒免疫伤寒 (SARS-CoV-2) 已在 220 多个国内和北部大大行其道，截至 2021 年 4 同年已造成了高达 1.28 亿人细菌感染，高达 280 数百人幸存者。理论上，不得而知可如此一来减低 COVID-19 生存率的伤寒患方法有。我们深入研究了一种现代的里药口服口服——关键在于肺毒口服液 (RDS) 的潜在炎传染伤寒免疫活性，该口服液主要化学成分为东方医学现代里常用伤寒患腹腔癌症的里肉桂。

结果：RDS 诱导 SARS-CoV 太快免疫、SARS-CoV-2 太快免疫、混合成乙型肝炎免疫-SARS-CoV-2(Ha-CoV-2) ；也型免疫以及传染性 SARS-CoV-2 和衍生的 Ha-CoV-2 品系免疫 (B.1.1.7、B.1.351、P.1、B.1.429、B.1.2、B.1.494、B.1.1.207、B.1.258 和 B.1.1.298) 对靶亚基的细菌感染。我们必要性显然 RDS 可以如此一来灭活 SARS-CoV-2 免疫胶体的传染性。此外，我们推断显露 RDS 还可切断乙型肝炎传染伤寒免疫对靶亚基的细菌感染。

论断：RDS 可广为诱导黏内层免疫细菌感染。ID：SARS-CoV-2，COVID-19，传染伤寒免疫，炎免疫伤寒患，关键在于肺毒口服液，现代里药，SARS-CoV，乙型肝炎传染伤寒，Ha-CoV-2，SARS-CoV-2 ；也型免疫

▋文化背景

目前于是以蔓延当今世界的新型传染伤寒免疫伤寒 (SARS-CoV-2) 已在 220 多个国内和北部大大行其道，截至 2021 年 4 同年已造成了高达 1.28 亿人细菌感染，高达 280 数百人幸存者。理论上，不得而知可如此一来减低 COVID-19 生存率的伤寒患方法有。新显露现的 COVID-19 免疫免疫为传染伤寒免疫 SARS-CoV-2[1]，是 SARS-CoV 在不堪重负急性痉挛囊肿系统性传染伤寒免疫品种里的姊妹免疫[2,3]。SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 最初都是在里国推断显露的；SARS-CoV 免疫于 2002 年 11 同年在广东省首次被推断显露[4-6]，SARS-CoV-2 则于 2019 年 12 同年在武汉首次被推断显露[1,7,8]。在里国，这两次由传染伤寒免疫引起的流感里，里药皆被广为运用于，以此紧急应对传染伤寒免疫引起的癌症。对于理论上的 COVID-19 大大行其道，里国有高达 85% 的 SARS-CoV-2 细菌感染患者接纳了现代里医药疗法（9，10）。许多运用于的里药是不是有着如此一来的炎传染伤寒免疫结构上并在外科上是不是如此一来，这个关键问题即已给予前提答复。

里药作为伤寒患传染伤寒免疫所引发癌症的如此一来疗法，但由于缺乏体内或活体的系统深入研究，其蓬勃发展与必要运用于皆受到了阻碍。为了断定里药的潜在炎 SARS-CoV-2 活性，我们从常用里药里审核了多种肉桂植物性，并从里药口服液 RDS(英美两国一种零售业性食品膳食) 里推断显露了炎 SARS-CoV 和炎 SARS-CoV-2 免疫的活性，一种在英美两国的零售业食品膳食。RDS 常用强化人体痉挛系统的总体肥胖，其举例来说多种肉桂化学成分，如当归和益母草，它们是现代上常用操纵增生和腹腔癌症的里肉桂 (11-13)。在此，我们华盛顿邮报 RDS 对 SARS-CoV、SARS-CoV-2 ；也免疫以及有着细菌细菌感染的野生型 SARS-CoV-2 免疫对靶亚基的细菌感染有着诱导作用。我们必要性假定 RDS 可通过如此一来灭活免疫胶体或制止免疫侵入而诱导免疫的现代细菌感染工作进展。此外，我们推断显露 RDS 还可以制止中三流免疫对靶亚基的细菌感染。这些表明，RDS 对黏内层免疫的细菌感染也许有着广为的诱导作用。

▋结果

为了从现代里肉桂里找到潜在的炎 SARS-CoV-2 活性，我们从约四十种现代肉桂里审核提取显露 SARS-CoV-2S 亚基；也型太快免疫[14,15] 和人体腹腔 A549(ACE2) 靶亚基，此全人类 ACE2 基因序列才会通过太快免疫转导作为核酸酪氨酸，从而稳定转导来实现超解读。太快；也型免疫运用于黄色白光亚基 (GFP) 或白光亦同酶 (Luc) 作为华盛顿邮报基因序列，并通过了有着广谱炎免疫踏入诱导剂，以及的卡萨克 (Arbidol)[16]，和全人类炎毒血清对炎 SARS-CoV-2(上图 1a、C) 的解析。我们必须成功样品到的卡萨克 (Arbidol) 和炎毒血清对于 SARS-CoV-2 ；也型免疫的诱导作用，这是我们在其他四十余种现代肉桂植物性测试者里没推断显露的，仅仅限于其里一些值得注意更高口服的肉桂 (上图 1a-C)。然而，鉴于太快性；也型免疫仅仅能样品 SARS-CoV-2 免疫的侵入行为，我们不能排除这些肉桂植物性也许有在踏入后阶段必须诱导 SARS-CoV-2 的也许性。我们必要性从现代口服关键在于肺毒口服液 (RDS) 里审核显露了也许的炎 SARS-CoV-2 活性，该其产品富内含则有肉桂化学成分——、苍耳、当归、益母草、龙胆、苦杏仁、蜂房、皂角、绿叶，在里国现代上常用伤寒患腹腔癌症 (11-13)。

富内含N-牛奶酯、3，4-二邻牛奶吡啶有效成分酯、N- 3，4-二邻牛奶吡啶有效成分酯、原儿茶酯、N-绿原酯和蓼草亦同；三叶里还富内含磷酸 A、B 和 10 种已知环酯醚CHO磷酸[17]；该豆科植物还富内含皂甙甙 A 和 B，以及炎增生作用的磷酸 C[18,19]。苍耳酯磷酸里富内含木脂亦同、松脂酰苍耳磷酸[20]。当归里富内含被称为当归皂磷酸的甾体皂磷酸，是当归属豆科植物类同的豆科植物中三醛[21,22]。紫花益母草里主要活性化学成分为四种单CHO，(−)-柠檬酮、(+)-普莱格酮、(−)-柠檬酯和 (+)-柠檬苯酚；这种豆科植物还富内含其他化合物，如 1-辛酯-3-醇、3-辛酮、β-同年桂酯和β-灯心草酯[23]。龙胆富内含高达 162 种化合物，仅仅限于环酯醚CHO和环酯醚CHO磷酸、苯丙磷酸、有机酯、CHO类、碳水化合物、黄酮类、和皂磷酸[24]。苦杏仁里富内含酚类、苯基化合物和淀粉胶原蛋白[25]。皂角刺里富内含皂磷酸和羽扇豆酯[26,27]，而绿叶里富内含主要活性化学成分绿叶酯[28]。为了必要性测试者 RDS 的炎 SARS-CoV-2 活性，用相异混和酸度的 RDS 出口处理程序 A549(ACE2) 亚基，然后让这些亚基在值得注意 RDS 的前提接纳 4-6 不间断的细菌感染。细菌感染后，在不值得注意 RDS 的前提培训亚基，然后在 48 和 72 不间断的时候，通过流德式亚基绝技对免疫细菌感染的诱导作用顺利进行假设。为了操纵亚基口服，运用于氰丙啶 (PI) 对将会幸存者和已幸存者的亚基顺利进行染料，仅仅在活亚基群里假设 GFP+亚基。如上图 2 标明，我们检视到 RDS 对 SARS-CoV-2(GFP) ；也免疫有着施打特异性诱导作用。为了推测这些结果，我们运用于诱导解读 ACE2 的 VeroE6 亚基减法了该细菌感染科学研究。

(可知下页上图)

ACE2 内外解读，生产厂性 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 免疫可对其顺利进行细菌感染，ACE2 一般而言常用传染伤寒免疫的深入研究 (7)。顾及在缺乏 ACE2 超解读 [15，29，30] 的前提，；也型免疫对 VeroE6 的细菌细菌感染极低，我们还运用于了白光亦同酶华盛顿邮报基因序列；也型免疫，该免疫的华盛顿邮报基因序列解读由 HIV-1LTR 和 Tat 驱动，有着更高的华盛顿邮报基因序列诱因和增益。

上图 2：RDS 诱导 SARS-CoV-2(GFP) ；也型免疫细菌感染 A549(ACE2) 亚基。

A.A549(ACE2) 亚基用 RDS 倒数混和 30 分钟后，用 SARS-CoV-2(GFP) ；也型免疫细菌感染。将亚基彩衣去免疫和 RDS，并在不值得注意 RDS 的前提顺利进行培训。流德式亚基郭子样品免疫细菌感染诱导也许。未细菌感染的亚基和细菌感染 SARS-CoV-2(GFP) 但未经 RDS 伤寒患的亚基作为对应。GFP+亚基倍数已辨识。(PI) 氰丙啶。

B.RDS 的亚基口服基本原理。A549(ACE2) 亚基用 RDS 倒数混和 4 不间断，彩衣去 RDS，无 RDS 培训 48 不间断。氰丙啶染料鉴定将要幸存者亚基和已幸存者亚基，流德式亚基绝技假设。所画施打-催化亚基口服斜率，RDS 的半伤人酸度 (LC50) %为 1:11.9。

如上图 3A 标明，我们运用于 Luc 报告基因序列；也免疫和 VeroE6 亚基顺利进行细菌感染科学研究，检视到 RDS 对该免疫细菌感染有着施打特异性诱导作用，并且分之二诱导酸度断定为 1:230RDS 混和度 (上图 3B)。我们还假设了 RDS 对 VeroE6 亚基气息的阻碍，断定了 50% 亚基幸存者施打为 1:11.8RDS 混和度。

上图 3：RDS 对 SARS-CoV-2(Luc) ；也免疫和野生型 SARS-CoV-2 免疫的施打特异性诱导诱导作用。用 RDS 倒数混和出口处理程序 A、BVeroE6 亚基，会用 SARS-CoV-2(Luc) ；也型免疫细菌感染。将亚基彩衣去免疫和 RDS，并在不值得注意 RDS 的前提顺利进行培训。在细菌感染后 72 不间断用白光亦同酶样品免疫细菌感染的诱导作用。未细菌感染亚基和 SARS-CoV-2-luc 细菌感染但未经过 RDS 伤寒患的亚基作为对应。科学研究减法三次。所画施打催化斜率和 RDS 的 I-C50 混和%为 1:230。CRDS 对 VeroE6 亚基的亚基口服也通过氰丙啶染料和流德式亚基绝技基本原理。用 RDS 倒数混和 4 不间断，彩衣去 RDS，在不内含 RDS 的前提培训 72 不间断。所画亚基口服施打-催化斜率，RDS 的半伤人酸度 (LC50) %为 1:13.8 混和。DRDS 诱导传染性 SARS-CoV-2 细菌感染。用倒数混和的 RDS 出口处理程序 VeroE6 亚基，并在 RDS 值得注意的前提细菌感染 SARS-CoV-2。细菌感染 48 不间断后，通过恶菌斑假设免疫释放后的免疫复制诱导也许。诱导检验一德式二分顺利进行，并在 Prism7(Graph Pad) 里运用于单向皆值 (One-Way ANOVA) 假设及 Dunnett 后检验 (Dunnett's Post Test)，便是断定统计数据显着性。不确定性值用请注意坚称如下：*p

为了必要性解析运用于；也免疫得到的结果，我们测试者了 RDS 对于 SARS-CoV-2 细菌感染的切断传染性潜能。如上图 3D 标明，RDS 同时也切断了 SARS-CoV-2 对 VeroE6 亚基的细菌感染。RDS 在混和 1:40 以上时可显著减少免疫斑纹的形成。

综上，通过 SARS-CoV-2 ；也免疫与传染性免疫的表明，RDS 富内含诱导 SARS-CoV-2 细菌感染的活性化学成分，也许是通过如此一来灭活免疫或切断免疫的现代细菌感染工作进展。

为必要性深入研究也许的组态，我们将传染性 SARS-CoV-2 免疫胶体与倒数混和的 RDS 在 37°C 下预培训 1 不间断。随后，将中三醇必要性依次混和-(10–1 至 10–4)，并投身于 Vero 亚基顺利进行恶菌斑假设以断定免疫细菌细菌感染的减低。如上图 4A 标明，我们检视到在 RDS 里在此之后掩盖一不间断后的免疫胶体，其 SARS-CoV-2 的细菌感染效价也呈圆形施打特异性下降。该结果推测了 RDS 可如此一来如此一来灭活 SARS-CoV-2 免疫胶体的传染性。

我们必要性测试者了 RDS 是不是也能诱导 SARS-CoV-2 免疫品系的细菌感染。为此，我们会用除此以外开发计划的混合成中三免疫-SARS-CoV-2 ；也型免疫 (Ha-CoV-2)[31] 来受控显露一系列 S 亚基例外，仅仅限于英国例外 (B.1.1.7)，尼日利亚例外 (B.1.351)，巴西例外 (P.1)，南加州例外 (B.1.429)，和其他几个新兴例外 (B.1.2，B.1.494，B.1.1.207B.1.258，B.1.1.298)。Ha-CoV-2(Luc) 和系统性 S 亚基人体内体在 37°C 倒数混和 RDS 培训 1 不间断。随后，用该中三醇细菌感染 HEK293T(ACE2/TMPRESS2) 靶亚基。细菌感染后 12 不间断，白光亦同酶测免疫细菌感染的诱导作用。如上图 4B 标明，我们还检视到了 RDS 对 Ha-CoV-2(Luc) 和所有 S 亚基例外的施打特异性诱导。

我们还测试者了 RDS 切断 SARS-CoV 细菌感染的潜能，运用于略带 SARS-CoV 突刺亚基的 GFP 华盛顿邮报基因序列太快免疫和[15] 假施打。我们将人 A549(ACE2) 亚基做为靶亚基，将其用系列混和的 RDS 出口处理程序，然后用 SARS-CoV(GFP) 报告基因序列；也免疫细菌感染 4-6 不间断。细菌感染后在不内含 RDS 的前提培训亚基，流德式亚基绝技假设样品其对免疫细菌感染的诱导作用。同样，运用于氰丙啶排除将要幸存者与已幸存者的亚基，仅仅在活亚基群里假设 GFP+亚基。如上图 5A 标明，我们检视到 RDS 对 SARS-CoV(GFP) ；也型免疫的诱导作用呈圆形施打特异性。我们必要性推测了这些结果，并假设了 RDS 酪氨酸的诱导与 Luc 华盛顿邮报基因序列 SARS-CoV ；也型免疫，SARSCoV(Luc)。我们检视到 RDS 对 SARS-CoV(Luc) 和的诱导作用呈圆形施打性依赖，其半诱导酸度 (IC50) 为 1:70.88 混和度 (上图 5B，C)。顾及 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 都运用于 ACE2 细菌感染靶亚基，我们还测试者了 RDS 的炎免疫活性是不是仅仅针对与 ACE2 有化学键的传染伤寒免疫。为此，我们样品了一种不系统性的负链 RNA 免疫--乙型肝炎传染伤寒免疫。它通过免疫血凝亦同 (HA) 和亚基α-唾液酯来细菌感染靶亚基。为了受控显露乙型肝炎传染伤寒免疫，将解读乙型肝炎传染伤寒 A/WSN/33(H1N1) 基因序列组每个片段的 8 个核酸和一个 GFP-华盛顿邮报基因序列共转染到 HEK293T 亚基里。在 RDS 值得注意的前提，获取免疫胶体并常用细菌感染目标 MDCK 亚基。如上图 6A 标明，我们检视到 RDS 对乙型肝炎传染伤寒免疫的诱导作用呈圆形施打特异性。RDS 在 1:40 和 1:80 混和时可完全切断免疫细菌感染，在 1:160 混和时则可部分诱导乙型肝炎传染伤寒。RDS 对 MDCK 亚基的半伤人酸度 (LC50) 经测为 1:18.5(上图 6B)。这些表明，RDS 的炎免疫活性并非针对特定免疫，而也许必须广为诱导多种黏内层免疫，如传染伤寒免疫和乙型肝炎传染伤寒免疫。

▋讨论

在本报告里，我们显然现代口服关键在于肺毒口服液 (RDS) 富内含广谱炎免疫活性，可切断 SARS-CoV、SARSCoV-2 和乙型肝炎传染伤寒免疫的细菌感染。虽然 RDS 必须诱导多种免疫，但其炎免疫活性因免疫类型和毒株而异。例如，对 SARS-CoV 太快；也免疫的 I-C50 酸度为 1:7.9 混和度，对 SARS-CoV-2 太快；也免疫的 I-C50 酸度为 1:230 混和度。对于传染性野生型 SARS-CoV-2 免疫，I-C50 为 1:40 混和度，对乙型肝炎传染伤寒，其 I-C50 为 1:250。RDS 对 Ha-CoV-2 及其品系有相异的诱导作用，IC50 数值从 1:70 到 1:2601 混和度差不多 (上图 4B)。

(可知下一页上图)

上图 4 RDS 对 SARS-CoV-2 和衍生的 Ha-CoV-2 品系有着施打特异性灭活作用。ASARS-CoV-2 胶体加倒数混和的 RDS 在 37°C 下培训 1 不间断。随后，将中三醇必要性倒数混和，并投身于 Vero 亚基里顺利进行恶菌斑假设，以断定免疫细菌细菌感染减低。诱导检验一德式二分顺利进行，并在 Prism7(GraphPad) 里运用于单向皆值 (One-WayANOVA) 假设和 Dunnett 后检验 (Dunnett'sPostTest) 便是断定统计数据显着性。不确定性值用请注意坚称如下：*p

BHa-CoV-2(Luc) 和系统性 S 亚基例外与倒数混和的 RDS 在 37°C 培训 1 不间断后，用中三醇细菌感染 HEK293T(ACE2/TMPRESS2) 靶亚基。细菌感染后 12 不间断，白光亦同酶测免疫细菌感染的诱导作用。RDS 的 IC50 值的混和度为 1:177(wt)，1:828(B.1.1.7)，1:124(B.1.351)，1:88(P.1)，1:134(B.1.1.207)，1:2601(B.1.1.298)，1:70(B.1.258)，1:362(B.1.429)，1:163(B.1.494)，1:137(B.1.2)。

我们必要性显然 RDS 可以诱导传染伤寒免疫的现代细菌感染工作进展。虽然确切的炎免疫组态即已清楚，但 RDS 可以通过如此一来灭活免疫胶体或通过制止免疫侵入或切断免疫侵入后的现代工作进展来制止免疫细菌感染。在其他几种现代里药里也推断显露了炎 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 的活性。例如，一种常可知的现代里药——绿叶。

绿叶根里已假定富内含绿叶酯亦同，可诱导 SARS 免疫[32] 外科受控株的复制。此外，另一种可常用伤寒患黏内层癌症的里药——双黄连口服，已辨识显露在活体以施打特异性方德式诱导 SARS-CoV-23CL 亚基酶 (3CLpro) 活性。石杉磷酸和石杉亦同拟作为双黄连切断 3CLpro[33] 的如此一来化学成分。

上图 5 RDS 诱导 SARS-CoV ；也型免疫对 A549(ACE2) 亚基的细菌感染。用倒数混和的 RDS 出口处理程序 A、B 亚基，用 SARS-CoV(GFP)(A) 或 SARSCoV(Luc)B ；也型免疫细菌感染。将亚基清彩衣，去掉免疫和 RDS，在不值得注意 RDS 的前提顺利进行培训。在细菌感染后 48 不间断和 72 不间断，通过流德式亚基绝技或白光亦同酶样品来基本原理免疫细菌感染的诱导作用。科学研究减法三次。所画施打作显露催化斜率，并所画 RDS 的 IC50 值为 1:70.9 混和度 (C)

上图 6 RDS 诱导中三流免疫对 MDCK 亚基的细菌感染。(A) 用倒数混和的 RDS 出口处理程序 MDCK 亚基 30 分钟，然后用中三流免疫 (GFP) 对其顺利进行细菌感染。细菌感染后，在 RDS 值得注意下培训亚基。36 不间断后用流德式亚基郭子对免疫细菌感染的诱导作用顺利进行基本原理。把未细菌感染的亚基与被中三流免疫 (GFP) 细菌感染但未经 RDS 出口处理的亚基顺利进行对比。上图里辨识了 GFP+亚基的倍数。PI 坚称氰丙啶 PI。

(B) 另外还运用于了 MTT 测法基本原理了 RDS 对 MDCK 亚基的口服，所画了亚基口服的施打-催化斜率，经计算，RDS 的分之二伤人酸度为 1:18.5 混和度 RDS 的如此一来炎免疫化学成分即已断定。然而，RDS 相异于石杉磷酸和石杉亦同，RDS 可以通过如此一来灭活免疫基本粒子来切断免疫细菌感染 (上图 4)，而石杉磷酸和石杉亦同则在免疫生命周期的初期通过切断免疫亚基酶的活性来值得注意。然而，RDS 的活体炎 SARS-CoV-2 活性仍需在现阶段的食肉动物深入研究和全人类外科检验里给予推测。目前，我们将要顺利进行小型食肉动物科学研究，以断定 RDS 在体内切断 SARS-CoV-2 免疫细菌感染的蓬勃发展前景。

▋论断

我们的深入研究表明，RDS 可广为诱导黏内层免疫的细菌感染，如 SARS-CoV、SARS-CoV-2 和乙型肝炎传染伤寒。

▋方法有

亚基和该组织培训

HEK293T (ATCC 佩拉格鲁，弗吉尼亚) MDCK (ATCC 佩拉格鲁，弗吉尼亚)，VeroE6 (ATCC 佩拉格鲁，弗吉尼亚) 和 A549 (ACE2) (来自 Virongy LLC 赠送，佩拉格鲁，弗吉尼亚)，和 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) (来自 Virongy LLC 赠送，佩拉格鲁，弗吉尼亚) 目前遗留于 Dulbecco's modifiedEagle's medium (DMEM) (赛默飞世尔新能源 Thermo Fisher Scientific) 富内含 10% 热灭活 FBS 和 1×青霉亦同-链霉亦同 (赛默飞世尔新能源 Thermo Fisher Scientific)。在 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) 该组织培训基里分别以 1μg/ml 和 200μg/ml 的酸度投身于嘌呤霉亦同和潮霉亦同 B。

原核生物转染和免疫受控显露

内含 SARS-CoVS 亚基或 SARS-CoV-2S 亚基的太快性；也型免疫胶体由 Virongy LLC (Manassas，VA) 给予，或按照上面叙述的方法有[15] 受控显露。简言之，为了受控显露 GFP 华盛顿邮报基因序列太快性；也免疫，HEK293T 亚基与解读 SARS-CoVS 亚基或 SARS-CoV-2S 亚基的核酸、pCMVΔR8.2 和 pLKO.1-puro-TurboGFP 共转染。为了一般而言白光亦同酶华盛顿邮报基因序列太快性；也型免疫，将 HEK293T 亚基与解读 SARSCoVS 亚基或 SARS-CoV-2S 亚基的核酸、pCMVΔR8.2 和 pLTR-Tat-IRES-Luc 顺利进行共转染。转染后 48 不间断获取免疫上清液，离心混和，−80℃ 遗留。野生型 SARS-CoV-2 免疫 (Isolate USA-WA1/2020) 由 BEI Bioresources (Manassas，VA) 给予。pHW-NAGFP (ΔAT6) 报告基因序列原核生物和 A/WSN/1933 H1N1 衍生原核生物 pHW2000-PB2、pHW2000-PB1、pHW2000-PA、pHW2000-HA、pHW2000-NP、pHW2000-NA、pHW20000M 由 FengLi 助手友好关系给予。在传染伤寒免疫 A-GFP 华盛顿邮报基因序列基本粒子受控显露里，将 pHW2000-pb2、pHW2000-pb1、pHW2000-PA、pHW2000-ha、pHW2000-np、pHW2000-na、pHW2000-m、pHW2000-ns 和 pHW-NA-GFP 共转染 HEK293T 亚基 (ΔAT6)。48 不间断后获取免疫上清液。SARS-CoV-2S、M、E、N 解读核酸购自 Sinobiological。会用 Twist Bioscience 合成了 Ha-CoV-2(Luc) 核酸和 S 亚基人体内核酸。Ha-CoV-2(Luc) 和 S 亚基人体内基本粒子按照上面叙述方法有[31] 顺利进行受控显露。

免疫细菌感染和口服诱导检验

RDS(关键在于肺毒口服液)(来自 Dejia Harmony 赠送，利斯堡，弗吉尼亚) 是由马助手科学研究室 (Burnaby，BC，Canada) 生产厂的一种零售业其产品。RDS 里所有里肉桂化学成分皆合乎《里国修订本 2015 年版》「饮片」标准规范，仅仅限于如此一来化学成分内含量及金属乐、除草剂普通版样品。RDS 是一种里药的共煎剂，终于产物在真空条件下蒸发。SARS-CoV-2 炎血清由 LanceA. Liotta 医生给予。将的卡朵尔盐酯盐 (Sigma) 继续碎屑在二N-亚砜 (Sigma) 里。对于；也型免疫细菌感染，12 孔板里的 A549(ACE2) 亚基 (来自 Virongy LLC 赠送，佩拉格鲁，弗吉尼亚) 或 VeroE6 亚基用 RDS 出口处理程序 30 分钟，在 37℃ 下细菌感染 4-6 不间断，然后在新鲜培训基里净水培训 48-72 不间断。对于 VeroE6 亚基的细菌感染，亚基也被 CoV-2 ；也型免疫细菌感染强化剂 (CoV-2PIE) (来自 Virongy LLC 赠送，佩拉格鲁，弗吉尼亚) 出口处理程序后，在 37°C 下再继续出口处理 30 分钟。运用于 GloMaxDiscover 酶标郭子 (Promega) 假设亚基裂解物的白光亦同酶活性。对于野生型 SARS-CoV-2 细菌感染，VeroE6 亚基在 37°C 下用 RDS 出口处理程序 30 分钟，然后用 MOI 为 0.05 细菌感染 SARS-CoV-2 (Isolate USA-WA1/2020；BEI Bioresources) 在詹姆士奥利弗该大学的 BSL-3 收容公共设施内驻留 1 不间断。亚基用 PBS 净水 2 次，用内含 RDS 的培训基培训 48 不间断。从上清里提取免疫，用 12 孔板培训的 Vero 亚基单层里的恶菌斑检验测小瓶滴度。简言之，每个样本在原始的 Dul-becco's ModifiedEagle 培训基 (VWR) 里受控显露，举例来说 1X 青霉亦同-链霉亦同 (VWR)，并填充 10% 的 FBS(赛默飞世尔新能源 Thermo Fisher Scientific)。然后将 200 微升的每种混和液独脚附到 VeroE6 亚基单层的三个平行孔上 1 不间断。然后用 1～2 ml0.6% 琼脂糖 (Invitrogen) 和一部分原始的 Eagle Minimal Essential 培训基 (VWR) 的中三醇覆盖单层，内含 1X 青霉亦同-链霉亦同，并填充 10%FBS。48 不间断后，将单层内层固定在 10% 中三醛氢氧化钠里 1 不间断，并去掉覆盖的琼脂塞。为了染料斑纹，投身于富内含 20% 丙酮的 1% 气态紫染料氢氧化钠 5 分钟，然后用去离子水净水。对于乙型肝炎传染伤寒免疫细菌感染 MDCK 亚基，在 37°C 下用 RDS 出口处理程序 30 分钟，然后用 A-GFP 华盛顿邮报基因序列免疫细菌感染 6 不间断。用内含 RDS 的培训基净水亚基，培训 36 不间断。GFP 解读通过流德式亚基郭子基本原理。(FACSCalibur，BD Biosciences).

对于 SARS-CoV-2 免疫胶体的 RDS 灭活检验，将 100μl 倒数混和的 RDS 填充到 1 mlSARS-CoV-2 免疫原液 (3.65×105PFU/ml) 里，终于 RDS 混和为 1:20，1:40 或 1:80。也仅仅限于对应条件 (1 ml 免疫+100μl 培训基)。中三醇在 37°C 下培训 1 不间断。随后，对中三醇顺利进行系列混和以产生额外的 1:10、1:100、1:1,000 和 1:10,000 混和度，并将倒数混和的样本投身于 12 孔板里的 Vero 亚基里，常用顺利进行恶菌斑测假设。斑纹测里终于的 RDS 混和度为 1:200 至 1:200,000；1:400 到 1:400,000；和 1:800 到 1:800,000 的 RDS 混和液。

Ha-CoV-2(Luc) 和 S 亚基人体内基本粒子按照上面叙述的方法有[31] 受控显露。对于 Ha-CoV-2(Luc) 的 RDS 灭活，将 5μl 倒数混和的 RDS 填充到 45μlHa-CoV-2(Luc) 或例外里，终于 RDS 混和度为 1:20、1:40、1:80、1:160 或 1:320。将中三醇在 37°C 下培训 1 不间断，然后在 RDS 值得注意下细菌感染 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) 亚基 12 不间断。运用于 GloMax Discover 酶标郭子 (Promega) 假设亚基裂解物的白光亦同酶活性。

亚基口服假设样品

用氰丙啶染料和流德式亚基绝技假设对 A549 (ACE2) 亚基和 VeroE6 亚基的口服亚基口服顺利进行样品，如所述 (34)。运用于亚基增殖试剂盒 I(MTT) (Sigma) 和制造商同意的方案对 MDCK 亚基的口服口服顺利进行假设。简言之，将 MDCK 亚基 (ATCC) 以每孔 1×-105 个亚基的平均速度接种到 12 孔板里。该组织培训隔夜后，通过 RDS 出口处理 1 天，然后在 MTT 上标试剂 (Sigma) 的培训基里培训。将亚基与上标试剂共同培训 4 不间断，再继续后续投身于 MTT 增氢氧化钠。培训皿孵育过夜，用 GloMax Discover 酶标郭子 (Promega) 测独脚光度。

缩写

SARS-CoV：不堪重负急性痉挛系统综合症系统性传染伤寒免疫；SARSCoV-2：Severe 不堪重负急性痉挛系统综合症系统性传染伤寒免疫-2；TCM：现代里药；RDS：黏内层奶口服液；Ha-CoV-2：混合成乙型肝炎新冠免疫；也免疫。

致谢

答谢 FengLi 给予传染伤寒免疫解读核酸，答谢 LanceLiotta 给予炎毒血清；答谢 TedCi，HeSun，ZhigangGao，WanyingWu 的讨论与同意；答谢 KevinCarter、MarkMamdar、RichKeurajian、KarenFreidouni 给予 RDS 和肉桂植物性。

编者开创性

此次科学研究由 Y.W.，R.H. 和 L.A.H. 所设计，由 Y.W. 主笔，由 L.A.H. 编辑。B.H.，D.Y.，A.A.O.，L.D.C.，S.H.，D.D、GA 及 YM 执行了该科学研究。所有编者已书本并审批终于稿件。

资金投入

本深入研究的经费来自于詹姆士奥利弗该大学内外款项 223741(DeJiaHarmony/Anti-SARS-CoV-2)，该款项由德佳和畅 (DeJiaHarmony) 给予。

数据和材料的复杂性

本深入研究里产生或假设的所有数据皆举例来说在本文里。试剂可从 Y.W 出口处获取。

声明

审批及投身于同意

不原则上

同意显露版社

不原则上

垄断利益

詹姆士奥利弗该大学国内生物防御和传染伤寒里心的 RMH 和 YW 已得到了德佳和畅 (DejiaHarmony) 的深入研究支助，LAH 为德佳和畅担任任职期间并得到了奖赏。没其他人关系或活动也许才会阻碍到草拟的工作。

编者的资讯

1英美两国弗吉尼亚詹姆士奥利弗该大学计算机科学该大学国内生物防御和传染伤寒里心，佩拉格鲁 20110。

2VirongyLLC，弗吉尼亚佩拉格鲁。3加拿大伯纳比，BCV5J0E5 马助手科学研究室 (Dr.Ma's LaboratoriesInc.)。4 英美两国弗吉尼亚利斯堡筹备会议科学该组织，20176。

收稿日期：2021 年 4 同年 7 日

接纳日期：2021 年 5 同年 10 日

线上显露版社星期：2021 年 5 同年 29 日

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